Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)이란 무엇인가요?

genome과 연결된 특정단백질을 동정하거나, 반대로, 특정단백질과 연결되어 있는 genome의 위치를 확인하기위한 방법입니다.
이 단백질들은 특정 아미노산에 modification이 일어난 Histone 혹은 chromatin관련 단백질들이 됩니다.
일단 단백질을 DNA에서 떨어지지 않도록 포름알데하이드로 고정을 시키고, 그후에 chromatin을 모아 항체를 사용하여 DNA-Protein complex를 면역침전(immunoprecipitation)시키고, 이로부터 얻어낸 DNA에 대하여 PCR을 하고 이후에 gel 전기영동을 통해 시퀀스를 확인하게 됩니다.

왜 DNA를 1000bp 이하로 절단해줘야 하나요?

최상의 ChIP 결과를 얻기위해서 1000bp 이하의 사이즈가 적절하기 때문입니다.
만약 절편의 크기가 1000bp 보다 크면, PCR을 하기위한 target sequence를 포함하는 DNA로 pull down 해야 합니다.

Primer는 어느정도 사이즈가 적당한가요?

primer의 제작은 효과적인 ChIP결과를 얻는데 있어 매우 중요한 요소가 되며, 다음의 조건을 갖추어야 합니다.
Primer Length: 24 nt
Optimum Tm: 60°C
Optimum GC: 50%
Amplicon size: 100-700 base pairs

Agarose를 block 하는데 왜 salmon sperm DNA를 사용해야 하나요? PCR할때 Salmon Sperm DNA가 같이 반응할 염려는 없나요?

Salmon sperm DNA는 agarose와 chromatin DNA의 비특이반응을 줄여줍니다.
salmon tissue 샘플로 ChIP을 할 경우가 거의 없기때문에, salmon sperm DNA는 primer와의 cross-hybridization으로 인한 증폭 염려가 없습니다.

Cross-link Histone이 필요하지 않을때도 있나요?

native ChIP을 할때, Histone H3와 Histone H4는 이미 타이트하게 연결되어 있으므로, cross-link할 필요가 없습니다.
Histone H2A와 Histone H2B는 타이트하지 않지만, native ChIP에서도 이용될수 있습니다.

Input DNA로 amplification이 잘 안됩니다. 왜 그럴까요?

amplification이 잘 되지 않을 때는 reverse cross-link가 잘 되지 않았거나 PCR 조건에 문제가 있는 것으로 생각됩니다.

PCR을 하기전 pellet을 어떻게 resuspension시키나요?

DW에 넣어 resuspension하세요. TE buffer안에 있는 EDTA가 PCR을 방해할수 있으므로 TB buffer에 녹이는것은 피해야 합니다.

Re-ChIp을 하기위해 agarose (sepharose)로 부터 antibody-protein-DNA complex를 elution 하는 방법을 알려주세요.

ChIP assay kit에 제공되는 elution buffer로 elution을 수행할수 있습니다.
re-ChIP을 하기위해서는, protease inhibitor를 IP wash buffer 및 elution buffer, dilution buffer에 넣습니다.
first complex를 모으고 second IP를 하는동안, 단백질들이 분해되지 않도록 냉장을 유지해야 합니다.

테스트 샘플보다 no-antibody control (negative control)에서 DNA가 더 많이 precipitation되는것 같은데, 왜그런가요?

negative control의 banding을 없애기 위해서 여러가지 방법이 있습니다.

1. 2ml pre-diluted cell pellet 부유액을 80ul의 Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% slurry로 4도에서 30분간 처리합니다. lysate가 맑아질때까지 더 길게, 더 많이 pre-clearing step을 진행해도 됩니다.
2. NFA내에서 밴드가 사라질때까지 관찰하면서 input DNA를 titration합니다.
3. 다른 방법의 lysis 과정을 사용할수 있습니다. : cell pellet을 protease inhibitor가 들어있는 200ul의 5mM Pipes pH8.0, 85mM KCl, 0.5% NP40에 resuspension 합니다.
   ice에 10분간 놓아둔뒤, 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 pellet을 얻습니다. pellet을 proetase inhibitor가 들어있는 200ul의 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH8.1에서 resuspension 합니다.
   ice에 10분간 놓아둡니다.
4. Salmon Sperm DNA Agarose를 1-5% BSA와 ChIP dilution buffer에 넣기전에 block시킵니다. incubation후에, agarose를 spin하여 1% BSA/ChIP assay buffer 상층액을 제거합니다.

Sonication을 하는데에 있어 좋은 방법이 있나요?

Sonication을 하는 동안 뿐만 아니라 실험을 하는 전과정 동안 cell을 ice에 보관하는 것도 하나의 방법입니다.
Sonication도 오래하는 것은 좋지 않으며, 30초 이상 하는 것은 샘플을 overheating과 denaturation시키는 결과를 낳게 됩니다.

왜 어떤 항체들은 ChIP에 잘 작용하고, 또 어떤항체들은 잘 작용을 안하는걸까요?

ChIP을 통해 좋은 결과를 얻고자 할 때에는 항체에 의해 인식될 수 있는 epitope이 cross-linking후에도 잘 남아 있어야 합니다.
또한 antibody가 강력하게 단백질과 결합해 있어야지만 세척 단계에도 제거되지 않고 남아있게 됩니다.

Transcription factor로도 이실험을 할수 있나요?

네, 가능합니다. 단 항체들은 quality가 매우 좋아야 하고, 최대의 cross-linking 효과를 위해 fixation 시간을 늘려줘야 합니다.

Wash buffer에 LiCl과 NaCl를 사용하는 목적은 무엇인가요?

다른 종류의 salt를 사용하는 것은 agarose bead와 non-specific chromatin 결합을 효과적으로 제거해줍니다.
Lithium은 다량의 SDS를 포함하는 buffer에서도 soluble합니다.

Reverse cross-link의 시간과 온도 조건을 변경해도 되나요?

Cross-link를 reverse하는데 걸리는 시간을 4시간 이하로 줄이는 것은 권해드리지 않습니다.
하지만 샘플을 dry 하지만 않게 해준다면 65℃에서 overnight 조건으로 할 수는 있습니다.

Kit내에 제공되는 Protein G Agarose/Salmon Sperm DNA를 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA로 바꿔서 사용해도 되나요?

네. Protein G Agarose는 mouse IgG primary antibody를 사용할때 이용됩니다.

Gene activation을 관찰하기 위해 primer에 포함되어 있어야 할 promotor는 무엇이 있나요?

Acetylated histone에 specific한 항체를 사용한다면, GAPDH는 아주 좋은 control입니다.

샘플을 동결시켜 실험을 잠시 stop 시킬 수 있는 단계는 언제가 있습니까?

실험을 hold 할 수 있는 단계는 몇 단계가 있는데, 먼저 cell pellet을 formaldehyde처리하고 세척해준 후 deep freezer에 보관 할 수 있습니다.
Lysate를 만든 후에도 -70℃에 보관 할 수 있으며, sonication후 chromatin을 보관할 수 있습니다.
샘플을 얼렸다 놓이는 것을 반복하는 것을 피하기 위해 aliquot하여 -70℃에 보관하는 것이 좋으며, reverse cross-linking하고나서 DNA purification전과 DNA purification 후 PCR을 하기 전에는 -20℃에 보관하시면 됩니다.