Proteomics 분석 서비스

2-D PAGE
• 1st Dimensional Isoelectrofocusing
  고객의 요구에 따라 길이 18 cm의 broad range IPG strip (pH3-10, linear, nonlinear, pH 4~7, pH 6~9)를 사용하거나 혹은 1 unit ranges (pH4.5-5.5 / pH5-6등등) IPG strip을 사용하여 시료 내에 존재하는 단백질을 각각의 등전점(pI)에 따라 분리합니다. 참고로 pH 1 unit range를 사용하고 Coomassie법으로 발색된 단백질 spot의 MALDI-TOF 분석 성공률은 90% 이상입니다.
• 단백질 크기에 따른 SDS-PAGE를 이용한 분리
  등전점에 의한 단백질의 분리 후 고객이 요구하는 폴리아크릴 아미드의 농도에 따라 구배 젤 (통상 8-16%)을 제조하여 크기에 따라 각각의 단백질을 분리하게 됩니다.
• 젤 발색법
  이차원적 전기 영동법에 의해 분리된 단백질의 image는 Colloidal Coomassie blue (CBB G250, R250), Sypro-Ruby등의 방법을 이용하여 발색 합니다. 혹은 MALDI compatible silver staining법을 이용해 발색하기도 하지만 이 경우는 MS를 이용한 단백질 동정의 성공률이 50- 60%로 낮은편 입니다.

MS를 이용한 단백질 확인 및 동정
• Proteomic analysis of 2-D Gel images
  2-D Gel 이미지 분석은 의뢰자들께서 image viewer(그림판)등에서 직접 육안 분석을 하실 수도 있으며, 의뢰시에는 image analysis software Melanie III (Genebio, Swiss)를 이용하여 통계적인 처리에 의한 data mining을 위해 수치화된 데이타로 만들어 드리는 서비스를 제공하여 드립니다. Total valid spot에 대해 normalized된 각각의 spot의 quantity로 출력합니다.
• Protein Identification
  2-D Gel 이미지로부터 찾아낸 특이 단백질 spot에 대한 확인 및 동정은 Matrix Assisted Laser Desorption Time-of-Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometer (MS)나 Liquid Chromatography-Coupled ElectroSpray Ionization MS/MS를 이용합니다.
  • Peptide Mass Fingerprinting을 통한 단백질 동정

    MALDI-TOF MS (Applied Biosystems Voyager-DE STR)를 보유하고 있어 정제된 단백질이나 2-D Gel로부터 얻은 단백질 spot을 In-gel상태나 용액 상태에서 trypsin등으로 가수 분해한 뒤 MALDI-TOF MS를 이용하여 peptide의 질량 지문 (peptide mass fingerprinting)을 얻어 이 정보를 가지고 기존의 data base와 비교, 분석하여 표적 단백질을 동정합니다.

  • Internal Peptide Amino Acid Sequencing 을 통한 단백질 동정
    

    LC coupled ESI-MS/MS (Thermo Finnigan LCQ DECA)를 보유하고 있어 정제된 단백질이나 2-D Gel에서 얻은 단백질 spot을 In-gel상태나 용액 상태에서 trypsin등으로 가수 분해한 뒤 peptide화 된 단백질의 일부 아미노산 서열을 밝혀 이 정보를 가지고 기존의 data base와 비교, 분석하여 표적 단백질을 동정합니다. 통상 3개 이상 peptide의 아미노산 서열을 분석하여 서비스를 제공하고 있으며 peptide당 확인되는 아미노산서열은 평균 8-14개 정도 입니다. 펩티드 지문에 대한 data base가 빈약하거나 없는 시료로부터 얻은 단백질 spot은 이 방법으로 분석합니다.
    
    추가로 의뢰자께서 요구하실 시 표적 단백질을 암호화하고 있는 유전자의 분리와 대장균에서의 대량 발현시키는 서비스도 제공하고 있습니다. 또한 이에 대한 항체 제작이나 펩티드 합성 서비스도 함께 제공할 예정입니다.

분석의뢰 절차 및 실험진행 절차
• 시료 분석 상담/ 예비견적서 요청
  • 2-D Gel 분석 서비스

    2-D Gel 분석을 위한 시료는 세포의 경우는 pellet상태로, tissue조각 상태로, fluid 경우는 최대한도 농축된 상태나 건조된 상태로 가장 적합한 보존 상태로 보내 주셔도 됩니다. 그러나 의뢰자께서 곧바로 2-D Gel분석을 할 수 있도록 시료를 준비하여 보낼 시는 다음 사항에 유의하여 준비하셔야 합니다.

    시료 준비시 주의 사항
    • 시료 단백질을 1차적으로 등전점에 따라 분리하기 위해서는 시료에서 salt, 핵산, polysaccharides, lipid등을 제거해 주어야 합니다.
    • 특별히 salt는 시료의 메탄올 침전, TCA/acetone 침전, centricon등을 사용하여 제거해 주어야만 합니다. 그렇지 않으면 Isoelectrofocusing시 strip이 타 버리는 문제가 발생합니다.
    2-D Gel 분석에 요구되는 시료의 단백질량
    

    MS compatible silver나 Sypro-Ruby staining을 기준으로 이상적인 단백질 발현분석을 위해서는 (normal gel: 18 cm 기준), 100-200ug/gel, Coomassie Blue staining을 위해서는 1- 2mg/gel의 단백질 양을 필요로 합니다. 시료에 따른 최적 분리 조건을 알기 위해 예비 실험을 해야 될 시에는 보다 많은 양의 시료를 필요로 합니다.

    • 시료에 따른 대략적인 단백질 농도
    • 박테리아: 건조량의 50%가 단백질량
    • 혈장/혈청: 60mg/ml
    • 1×107 진핵세포: 1mg
    • Mammalian tissue: 동결 건조된 10 mg의 조직에서 1 mg의 시료 단백질 추출 가능
    • 뇨: 약 500 ml.
  • 단백질 확인 및 동정 서비스

    단백질 동정을 위해 아래와 같은 서비스를 제공합니다. 2-D Gel에서 얻은 단백질 spot의 동정 뿐만이 아니라 유전자 재조합으로 대량 발현 시킨 단백질도 단백질의 정제 과정 없이 아래의 방법을 이용하여 Western blot이나 ELISA법 대신으로 빠르고 신속하게 확인 및 동정할 수 있습니다.

    Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF MS
    • 시료 단백질을 1차적으로 등전점에 따라 분리하기 위해서는 시료에서 salt, 핵산, polysaccharides, lipid등을 제거해 주어야 합니다.
    • 특별히 salt는 시료의 메탄올 침전, TCA/acetone 침전, centricon등을 사용하여 제거해 주어야만 합니다. 그렇지 않으면 Isoelectrofocusing시 strip이 타 버리는 문제가 발생합니다.
    Internal Peptide Amino Acid Sequencing using LC-coupled ESI-MS/MS

    이 방법은 LC-coupled ESI-MS/MS를 이용하여 peptide화 된 단백질의 일부 아미노산 서열을 밝혀 이 정보를 가지고 기존의 data base와 비교, 분석하여 표적 단백질을 동정하는 서비스입니다. 통상 3개 이상 peptide의 아미노산 서열을 분석하여 서비스를 제공하고 있으며 peptide당 확인되는 아미노산서열은 평균 8-14개 정도 입니다. 보다 정확한 단백질의 동정을 필요로 할 때나 희귀 단백질, 희귀 시료로부터 얻은 단백질의 동정 시 이 방법을 사용합니다.

    최상의 단백질 동정 성공률을 위해서는 1 unit pH 단위로 분리된 2-D Gel을 Coomassie blue G250 나 Sypro-Ruby staining으로부터 얻은 spot의 분석을 권합니다 (동정 성공률 90% 이상). 젤의 silver staining이 부득이한 경우는 아래에서 언급한 MALDI compatible silver staining법을 이용해야만 합니다 (동정 성공률 60% 정도). 그리고 이 방법으로부터 얻은 spot의 동정 의뢰시는 시료를 배송하기 전에 고마바이오텍 담당자와 반드시 상담하셔야 합니다.

    • Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M. 1996 Mass spectrometric sequencing of proteins from silver stained polyacrylamide gels. Analytical Chemistry 68(5):850-858.
    • Blum H, Beier H, Gross HJ. 1987 Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8:93-99.
    • 기타 MS compatible commercial kit (BioRad silver stain plus kit등)

    MS를 이용한 단백질 확인 및 동정을 위한 시료 준비법
    MS를 이용한 단백질 동정을 하기 위해 시료를 준비할 때 keratin에 오염되지 않도록 특별한 주의를 요합니다. Keratin에 의한 시료의 오염은 단백질 동정에 심각한 영향을 주게 됩니다.

    • MALDI-TOF 분석시 최소 100ng 이상, LC coupled ESI MS/MS 분석 시는 3 pmol 이상의 단백질이 필요함.
    • spot의 크기는 직경 1 mm내외의 크기로 최대한도로 작게 젤에서 분리해야 함.
    • 시료의 Desalting, detergent 제거 및 농축을 위해 ZIP tip 사용을 권장함(silver staining으로 부터 얻은 시료는 이 과정이 반드시 필요).
    • 분리한 젤은 물기가 없는 상태로 effendorff tube에 넣어서 배송.

• 실험 및 분석 결과 보고

  모든 분석 의뢰는 최선을 다해 실시합니다.보완이 필요할 경우 사후 서비스를 해 드리며 모든 자료는 CD로 보내 드리거나 혹은 PDF file형태로 이메일을 통해서 보내드립니다.

  2-D Gel을 이용한 시료 분석시는 시료에 따른 최적 조건을 찾는 예비 실험을 포함하여 발색을 하는데 까지 약 20일이 소요됩니다. 또한 Melani III 프로그램을 이용한 젤 이미지 분석에 약 1주일 정도 소요 됩니다.

  MALDI-TOF 분석 서비스는 sample 접수 후 분석까지 통상 7일 정도 소요됩니다.

  LC coupled ESI-MS/MS 서비스는 sample 접수 후 분석까지 약 7일 정도 소요됩니다. 그러나 이러한 분석 시간은 시료의 양이나 대기 시료량에 따라 늦어질 수 있습니다. 최대한으로 빠른 시일 내에 최상의 서비스를 제공할 수 있도록 노력하겠습니다.

• 분석 비용 산출 및 세금계산서 발송

  용역 서비스 내용에 따른 실제 비용을 산출하여 의뢰자께서 작성해 주신 사항에 따라 세금 계산서를 발급하여 드립니다.

• 시료 보내실곳
  고마바이오텍(주) 담당자
  • 주소: (우:157-793) 서울시 강서구 가양3동1487번지 가양테크노타운 301호 고마바이오텍(주)
  • 전화: 02-579-8787, 팩스 : 02-578-7042
  • 이메일문의: koma@komabiotech.co.kr

• MOA (Mode Of Action) - Protein expression profiling 서비스