특징
- 다양한 크기 (최대 240kDa)의 여러 단백질을 세포질로 전달하기 위한 protein transfection reagent 입니다.
- 세포내 전달 메커니즘은 membrane fusion을 통해 이루어집니다.
- Cas9 ribonucleoprotein을 세포내로 운반할 수 있어, 유전자 편집 실험에도 효과적으로 사용됩니다.
- 일차 세포, T 세포, B 세포 및 줄기 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서, in vivo 및 in vitro로 사용할 수 있습니다.
- 에탄올(10mg/mL)에 미리 용해되어 공급됩니다.
실험 데이터
ProtiFect STAR™가 음전하와 양전하를 모두 띠는 다양한 단백질을 세포 내로 효과적으로 전달하는 능력을 시판 제품과 비교하였습니다.
Application of ProtiFect STAR™ Protein Transfection Reagent. Intracellular delivery of negatively charged green fluorescence protein (GFP), superoxide dismutase (SOD), ovalbumin (OVA), and positively charged lysozyme with a commercially available protein transfection reagent and ProtiFect STAR™. Proteins and ProtiFect STAR™ were used 8 μg/mL (n = 3). Scale = 25 μm.
ProtiFect STAR™ 시약은 293T 세포에서 유전자 편집 표적인 AAVS1에 대해 37.8%의 높은 편집 효율(indel 빈도)을 보이며 CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 성공적으로 전달했음을 보여줍니다.
Application of ProtiFect STAR™ Protein Transfection Reagent. Intracellular delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes with ProtiFect STAR™ in 293T cells targeting adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1), leading to an indel frequency of 37.8%.
ProtiFect STAR™ 시약은 SW-480 세포에서 KRAS 유전자 편집을 위해 CRISPR/Cas9 RNP를 효율적으로 전달했으며, 그 편집 효과는 염기서열 분석을 통해 확인되었습니다.
Application of ProtiFect STAR™ Protein Transfection Reagent. Intracellular delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes with ProtiFect STAR™ in SW-480 cells targeting KRAS locus. CMAX was used as a positive control. Sanger sequence (lower panel) performed by T-A cloning at KRAS locus was obtained from SW-480 cells. Three sequences of clones with mutations were represented. Cas9 protein, sgRNA, and ProtiFect STAR™ were 2, 1, and 4 μg/mL, respectively.
ProtiFect STAR™ / Protein Complex 제조 방법
1. HEPES buffer (20mM, pH7.4)에 희석하여 1mg/ml ProtiFect STAR solution을 만듭니다. (5ul ProtiFect STAR in ethanol to 45ul HEPES buffer)
2. 1번 용액 20ul에 28ul HEPES buffer로 희석합니다. 30ul의 희석된 ProtiFect STAR™ solution과 20ul의 protein solution을 혼합하여 complex solution을 만듭니다. (1 μL of 1 mg/mL protein, e.g., Cas9/RNP, with 19 μL HEPES buffer) 1분간 incubation 합니다.
3. ProtiFect STAR™ protein complex solution을 450ul의 serum-free DMEM 이나 Leibovitz’s L-15 medium에 섞고, cell에 처리합니다.
*최대 효율을 내기 위해서 혼합하는 양은 cell이나 단백질에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
In Vitro CRISPR/Cas9 Genome Editing 연구시 Cas9/RNP의 delivery 방법
1. 24-well plate에 cell을 seeding하고 (1x10^5 cells) overnight culture 합니다.
2. 상기 프로토콜에 따라 ProtiFect STAR™와 Cas9/RNP를 혼합하여 complex solution을 만듭니다. Cas9 protein, sgRNA, ProtiFect의 추천 농도는 각각 2, 1, 4ug/ml 입니다.
3. Cell culture medium을 제거하고 cell을 PBS로 세척합니다.
4. 500ul의 ProtiFect STAR Cas9/RNP complex solution을 각 well에 처리하고 37도에서 4시간동안 incubation 합니다.
5. Cell을 fresh culture media로 교체하고 추가 48시간 동안 incubation한뒤 분석에 사용합니다.