1. TcBuster란 어떤 기술인가요?
TcBuster는 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로, DNA 트랜스포존을 이용하여 유전자를 세포 내로 도입하고 안정적으로 통합시키는 기술입니다. 바이러스 벡터와 달리 비표적 세포에 유전자를 도입할 위험이 적고, 세포 치료제 개발에 안전하게 사용할 수 있습니다.
2. 어떤 세포 유형에 적용 가능한가요?
TcBuster 시스템은 다재다능한 유전체 편집 도구로서 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다. TcBuster는 다음과 같은 분야에 유용합니다.
- T 세포, NK 세포, 유도 만능 줄기세포(iPSC)와 같은 세포에서 유전체 변형을 위한 세포 치료 응용
- CHO 세포나 HEK293과 같은 안정적인 생산 세포주 생성
- 질병 모델과 약물 스크리닝을 위한 세포주 개발
3. 어떤 장점을 가지고 있나요?
높은 유전자 도입 효율과 안정적인 유전자 통합, 바이러스 벡터 사용에 비해 시간과 비용 절감, 그리고 세포 독성 감소 등이 있습니다.
4. 바이러스 벡터와 어떻게 다른가요?
바이러스 벡터는 유전자 도입 과정에서 예상치 못한 부작용이나 면역 반응을 유발할 수 있지만, TcBuster는 이러한 문제점을 해결하여 더욱 안전하고 효율적인 유전자 전달이 가능합니다.
5. 어떤 방식으로 유전자를 도입하나요?
TcBuster 시스템은 mRNA transposase와 DNA transposon을 세포 내로 도입하여 유전자를 세포내로 전달합니다.
6. 세포 치료제 개발에 어떻게 활용되나요?
CAR-T 세포, CAR-NK 세포 등 세포 치료제 개발에 필요한 유전자 도입 및 안정적인 발현을 위해 사용됩니다.
7. 유전자 도입 원리를 상세히 알려주세요.
TcBuster는 여러 세포 유형에서 안정적인 유전자 전달을 위한 비바이러스성 유전자 편집 시스템으로, DNA 전위(트랜스포지션)를 기반으로 합니다.
1) TcBuster 시약은 mRNA 전위효소(transposase)와 DNA 전위인자(transposon)로 구성되며, 전기천공법(electroporation)을 통해 세포 내로 도입됩니다.
2) 세포 내로 들어가면 TcBuster mRNA는 전위효소 단백질 (TcBuster transposase)로 번역됩니다.
3) 전위효소는 DNA transposon 내 유전자 관심 부위(GOI)를 감싸는 특정 부위인 역말단 반복서열(ITR, inverted terminal repeats)에 결합합니다.
4) TcBuster는 transposon으로부터 DNA 운반체(cargo)를 절단해냅니다.
5) TcBuster transposase는 DNA 운반체를 숙주 세포의 게놈 내 AT 뉴클레오타이드 부위에 무작위로 삽입합니다.
6) 삽입된 DNA 운반체는 mRNA로 전사되고,
7) 이후 단백질로 번역되어 안정적인 유전자 발현을 일으킵니다.
8. 어떤 electroporation 장치를 권장하나요?
모든 장치와 호환될 것으로 생각되지만, Bio-Techne는 Lonza Nucleofector, ThermoFisher Neon, MaxCyte 기기를 사용하였습니다.
9. 트랜스포손의 운반체(cargo) 크기 제한이 있나요?
이론적으로 운반체 크기의 최대 제한은 없습니다.
일반적으로 CAR 또는 TCR 세포 치료 응용을 위한 대부분의 구성물에서 40% 이상의 유전자 편집 효율을 관찰하였습니다. 하지만 구성물의 크기와 복잡성이 증가함에 따라 전위(transposition) 효율은 감소할 수 있습니다.
10. T 세포와 NK 세포는 전위(transposition) 후 생존하고 증식하나요?
네, T 세포와 NK 세포 모두 수확 시 생존율이 90% 이상이며, 여러 가지 배지에서 G-Rex 시스템을 통해 활발하게 증식합니다.
11. CAR 또는 TCR 기반 치료를 위해 여러 유전자를 하나의 벡터에 담을 수 있나요?
네, TcBuster를 사용하면 단일 트랜스포손으로 여러 유전자(즉, 다중시스트론, multicistronic)를 한 번에 전달할 수 있으며, 바이러스 벡터와 동등하거나 더 높은 편집 효율을 보입니다.
바이러스 벡터도 여러 유전자를 운반할 수 있지만, 포장(packaging) 제한 때문에 수율이 불안정하고 낮은 편입니다.
TcBuster 트랜스포손 시스템은 크고 복잡한 DNA 운반체를 전달하는 데 이상적입니다.
12. TcBuster의 유전체 삽입 특성은 어떠하며, 렌티바이러스 벡터와 어떻게 비교되나요?
TcBuster의 삽입 특성은 렌티바이러스 벡터에 비해 더 무작위적입니다.
렌티바이러스는 주로 전사 단위 내에 삽입되며, 75% 이상이 엑손(exon)과 전사체(transcript)에 삽입됩니다.
반면 TcBuster는 엑손과 전사체 삽입이 20-30% 감소한 것으로 나타났습니다.
따라서 TcBuster 시스템은 활성 유전자를 방해할 가능성이 더 낮습니다.
자세한 내용은 ‘Lentiviral vs. Non-Viral Delivery for CAR-T Manufacturing’ 애플리케이션 노트를 참고하세요.
13. 세포 치료 응용에서 허용 가능한 벡터 복제 수(Vector Copy Number, VCN)는 어느 정도인가요?
렌티바이러스 벡터의 경우, FDA 가이드라인은 게놈 당 복제 수가 5회 이하(≤ 5 copies per genome equivalent)를 권장합니다.
DNA 트랜스포손 시스템에 대한 공식 가이드라인은 없지만, Bio-Techne에서는 T 세포와 NK 세포 모두에서 높은 유전자 전달 효율을 유지하면서 복제 수를 8회 이하(≤ 8)로 낮추는 것을 목표로 여러 플랫폼에서 프로토콜을 개발했습니다.
14. 전위효소(transposase)는 언제 세포에서 제거되나요? 유전체 내에서 계속 복사-붙여넣기(copy and paste)를 하나요?
대부분의 전위 작용은 electroporation 후 48시간 이내에 일어납니다.
qRT-PCR을 이용해 TcBuster-M mRNA를 검출할 수 있으며, 이 mRNA는 시간이 지남에 따라 분해되어 electroporation 후 7일째에는 검출되지 않습니다.
또한 TcBuster-M 전위효소 단백질을 검출하기 위한 항체도 만들어졌으며, electroporation 후 2~3일 이내에 세포 내에서 전위효소가 더 이상 검출되지 않습니다.
이는 TcBuster 시스템을 이용한 편집이 일시적(transient)이며 장기간 지속되지 않음을 시사합니다.
15. Sleeping Beauty와 PiggyBac 트랜스포손에 대해 들어봤는데, TcBuster는 어떻게 다른가요?
Sleeping Beauty와 PiggyBac처럼 TcBuster도 DNA 트랜스포손 시스템입니다.
직접 비교했을 때, TcBuster는 세포 치료 응용에서 편집 효율과 복제 수 측면에서 이들 다른 트랜스포손 시스템과 비교해 우수한 성능을 보입니다.
또한 TcBuster는 유일하게 독점적이지 않고 상업적으로 이용 가능한 시스템입니다.
16. TcBuster 시스템이 임상에서 사용된 적이 있나요?
현재까지 TcBuster-M mRNA는 Luminary Therapeutics의 3건의 임상시험신청서(IND)에서 승인을 받았습니다.
자세한 내용은 여기에서 확인하세요.
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